← Wissen · Aktualisiert am 6. November 2026 · 5 Min. Lesezeit
HPLC und Massenspektrometrie (MS) beantworten unterschiedliche Fragen. Deshalb werden sie in der Peptidanalytik meist kombiniert.
RP-HPLC
Die Umkehrphasen-HPLC trennt Komponenten nach ihrer Hydrophobizität. Die Detektion erfolgt typischerweise im UV-Bereich um 214 bis 220 nm, wo die Peptidbindung absorbiert. Die Reinheit wird als Anteil der Hauptpeak-Fläche an der Gesamtfläche angegeben.
Ein einzelner Peak beweist keine Identität. Mitlaufende Verunreinigungen können im selben Peak liegen, und Salze oder Wasser sind in dieser Messung nicht sichtbar.
Säule, Laufmittel und Gradient
Für Peptide ist eine C18-Umkehrphasensäule der Standard. Laufmittel A ist Wasser, Laufmittel B Acetonitril, beide meist mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA). Die TFA wirkt als Ionenpaarreagenz: Sie bindet an basische Reste und sorgt für schärfere Peaks. Während des Laufs steigt der Anteil an Acetonitril, oft über 20 bis 40 Minuten, etwa von 5 auf 65 %. Hydrophobere Peptide lösen sich erst bei höherem Acetonitrilanteil von der Säule.
Für die Kopplung mit der Massenspektrometrie wird TFA häufig durch Ameisensäure ersetzt. TFA unterdrückt das Signal im Elektrospray deutlich. Deshalb können sich Chromatogramme aus einer reinen HPLC-Prüfung und aus einer LC-MS-Messung im Aussehen unterscheiden.
Ein Chromatogramm lesen
- Retentionszeit: wann ein Stoff die Säule verlässt. Hydrophobere Peptide erscheinen später.
- Hauptpeak: das Zielpeptid. Seine Fläche ergibt die Reinheit in Flächenprozent.
- Nebenpeaks: andere peptidische Stoffe. Kleine Peaks direkt neben dem Hauptpeak sind oft eng verwandte Nebenprodukte.
- Basislinie und Integration: Wo die Auswertung Peaks beginnen und enden lässt, beeinflusst das Ergebnis. Ein beigelegtes Chromatogramm macht die Zahl nachprüfbar.
Warum zwei Labore verschiedene Reinheiten messen können
Die HPLC-Reinheit ist kein Naturwert, sondern hängt von der Methode ab. Eine andere Säule, ein flacherer Gradient oder eine andere Wellenlänge können Verunreinigungen sichtbar machen, die vorher unter dem Hauptpeak lagen. Auch die Integration, also wo ein Peak beginnt und endet, beeinflusst die Zahl. Zwei Werte von 98,1 % und 97,4 % aus verschiedenen Laboren widersprechen sich deshalb nicht unbedingt.
Für eine belastbare Aussage helfen orthogonale Methoden: zwei Trennverfahren mit unterschiedlichem Prinzip, etwa Umkehrphase und Ionenaustausch. Liegt die Reinheit in beiden hoch, ist eine verdeckte Verunreinigung unwahrscheinlich. Ein Diodenarray-Detektor kann zusätzlich prüfen, ob das UV-Spektrum über den ganzen Hauptpeak gleich bleibt.
Massenspektrometrie
Die MS, oft als ESI-MS oder MALDI-TOF, bestimmt das Masse-Ladungs-Verhältnis. Stimmt die gemessene Masse mit der berechneten überein, stützt das die Identität. Isomere Verbindungen mit gleicher Masse, etwa Peptide mit vertauschter Sequenz, lassen sich so allein nicht unterscheiden. Dafür ist eine Fragmentierung (MS/MS) nötig.
Mittlere und monoisotopische Masse
Massenangaben können sich auf zwei Werte beziehen. Die monoisotopische Masse berechnet sich aus den häufigsten Isotopen jedes Elements. Die mittlere Masse berücksichtigt das natürliche Isotopenverhältnis und ist etwas größer. Bei kleinen Peptiden und hochauflösenden Geräten wird meist die monoisotopische Masse ausgewertet, bei größeren Peptiden oft die mittlere. Ein Zertifikat sollte angeben, welche gemeint ist. Sonst kann ein Unterschied von etwa einem Dalton fälschlich wie eine Abweichung aussehen.
Hochauflösende Geräte wie Orbitrap- oder moderne TOF-Systeme messen die Masse auf wenige ppm genau. Damit lassen sich auch kleine Veränderungen wie eine Desamidierung von +1 Da sicher erkennen.
MS/MS: die Sequenz bestätigen
Die Masse allein sagt nicht, in welcher Reihenfolge die Aminosäuren stehen. Dafür wird ein Peptid-Ion im Massenspektrometer gezielt zerlegt, meist durch Stöße mit einem Gas. Die Bruchstücke entstehen bevorzugt an den Peptidbindungen und bilden zwei Serien, die b- und die y-Ionen. Der Massenabstand zwischen aufeinanderfolgenden Bruchstücken entspricht jeweils einer Aminosäure. So lässt sich die Sequenz Schritt für Schritt ablesen. Eine MS/MS-Prüfung ist aufwendiger und steht nicht auf jedem Zertifikat, schließt aber Verwechslungen mit sequenzvertauschten Peptiden gleicher Masse aus.
LC-MS: beide Methoden in einem Lauf
Bei der LC-MS ist die Flüssigchromatographie direkt mit dem Massenspektrometer gekoppelt. So erhält jeder Peak im Chromatogramm seine eigene Masse. Das zeigt, ob der Hauptpeak das Zielpeptid ist und was die Nebenpeaks sind. Für eine Identitätsprüfung ist LC-MS heute der übliche Weg.
Typische Verunreinigungen und ihre Masse
| Verunreinigung | Woran man sie in der MS erkennt |
|---|---|
| Fehlsequenz (eine Aminosäure fehlt) | Masse um den Rest der fehlenden Aminosäure kleiner |
| Abgebrochene Sequenz | Deutlich kleinere Masse |
| Oxidiertes Methionin | +16 Da |
| Desamidierung von Asparagin oder Glutamin | +1 Da |
| Unvollständig entfernte Schutzgruppe | Masse um die Schutzgruppe größer |
HPLC als Mengenbestimmung
Mit einem Referenzstandard bekannter Menge kann die HPLC auch die Menge eines Peptids bestimmen. Dazu wird die Peakfläche der Probe mit der Fläche des Standards verglichen. So wurden auch die früheren Proben von Alpenpeptid ausgewertet: Die gemessene Menge im Vial ergab sich aus dem Vergleich mit einem Referenzchromatogramm. Die Genauigkeit hängt dabei von der Qualität und dem Peptidgehalt des Standards ab.
Was keine der beiden Methoden liefert
Keine der beiden Methoden gibt den Peptidgehalt der Einwaage an. Dafür sind Verfahren wie die Aminosäureanalyse oder die Stickstoffbestimmung nötig.
Auch Sterilität, Endotoxine und Schwermetalle erfassen HPLC und MS nicht. Dafür gibt es eigene Prüfungen. Welche Angaben auf einem Zertifikat stehen sollten, zeigt der Artikel Analysenzertifikat für Peptide richtig lesen. Wie die früheren Proben von Alpenpeptid gemessen wurden, steht unter Methoden.
Häufige Fragen
Reicht eine HPLC-Reinheit ohne Massenspektrum? Nein. Die HPLC zeigt, wie viel vom Hauptpeak vorhanden ist, aber nicht, ob der Hauptpeak das richtige Peptid ist. Dafür braucht es die Massenspektrometrie.
Warum sehe ich im Spektrum mehrere Signale für ein Peptid? Bei der Elektrospray-Ionisierung nimmt ein Peptid unterschiedlich viele Protonen auf. Jede Ladungsstufe erscheint als eigenes Signal. Zusammen ergeben sie dieselbe Masse.
Welche Wellenlänge ist für die Reinheit die richtige? Für Peptide sind 214 bis 220 nm üblich, weil dort die Peptidbindung absorbiert. Eine Messung nur bei 280 nm erfasst Verunreinigungen ohne aromatische Reste nicht und kann die Reinheit zu hoch erscheinen lassen.
Was bedeutet „LC-MS-bestätigt“ auf einem Zertifikat? Dass die Masse des Hauptpeaks per LC-MS gemessen wurde und zur berechneten Masse passt. Es ist ein Identitätsnachweis, aber noch keine vollständige Sequenzbestätigung.
Kann ich ein Chromatogramm selbst nachrechnen? Mit der Peaktabelle ja. Teilen Sie die Fläche des Hauptpeaks durch die Summe aller Flächen. Weicht das Ergebnis von der angegebenen Reinheit ab, fragen Sie nach, welche Peaks bei der Auswertung ausgeschlossen wurden, etwa Lösungsmittel- oder Systempeaks.
Nur für Forschungszwecke im Labor. Nicht zur Anwendung am Menschen oder Tier.
